Tecnica de edición de Acidos Nucléicos en ECV

Título del artículo: Sema4D/PlexinB1 inhibition ameliorates blood–brainbarrier damage and improves outcome after stroke in rats

Tipo de edición: In vivo de células somáticas
Dirigidas hacia (diana molecular): Gen PLXNB1 que codifica para la proteína plexina B1 que activa la proteína inflamatoria semaforina 4D SEMA4D - inhibición de la expresión de ADN 

Dirigido por: Sistema CRISPR-Cas9
Uso de vectores: Vector lentiviral de ARN guía único (ARNsg)

Órgano/clula a tratar: Barrera hematoencefálica 
                                     Microglia y endotelio disfuncional del Sistema Nervioso Central
                                     Astrocitos perivasculares cercanos a la Arteria Cerebral Media
Vía de administración: Parenteral, tres inyecciones corticales en el hemisferio derecho situándose cerca del punto de confluencia anatómica bregma
Resultados: 
1. Corto plazo: 3 días postinyección, hubo una reducción de la expresión del sistema Sema4D/Plexin B1, decrecimiento del infarto y baja  permeabilidad de la barrera hematoencefálica.
2. Mediano plazo: 7 días postinyección, reducida respuesta inflamatoria después del infarto cerebral al modificar la acción proinflamatoria CD11b de macrófagos y astrocitos, lo que disminuye la probabilidad del edema local. 
3. Largo plazo: Pese a que la inhibición del sistema inflamatorio Sema4d/Plexin B1 muestra resultados alentadores, es necesario estudiar la posible acción adversa contra otros marcadores inflamatorios como TNF-a e IL-1b porque podría inmunodeprimir al paciente en otras afecciones. 

La inhibición del sistema Sema4D/PlexinB1 reduce el volumen de infarto como se muestra en las gráficas.

Fuente: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29242274/

Terapia con "Stem Cell" en la Enfermedad Cerebrovascular

 Análisis artículo: Human neural stem cells in patients with chronic ischaemic stroke (PISCES): a phase 1, first-in-man study

1) Tipo de célula: Célula mesenquimal neural CTX-DP (human neural stem cell) 

2) Método de obtención:  Trasplante alogénico de células criopreservadas CTX0E03 derivadas el neuroepitelio cortical fetal con el trans gen c-mycER-TAM.

3) Administración: Vía parenteral, implantación de células a nivel del putamen en el cerebro.

4) Resultados

Corto plazo: 1 mes, hematoma extradural y hematoma subdural (ambos de carácter asintomático)

Mediano plazo: En cinco pacientes de los onces de estudio se observó inflamación local, reacción huesped-injerto (Complejo mayor de Histocompatibilidad), gliosis y desmielinización a los 24 meses de la operacion.

Largo plazo: En 6 pacientes de estudio de los once se observó mejora en la funcion neuronal como reducida espasticidad muscular, mayor agilidad motora, menor tiempo en la realización de movimientos voluntarios y leve angiogénesis cerebral a los 32 meses de la operación. Sin embargo, no se afirma que sea una cura frente a un ECV puesto que es parte de una investigación terapéutica fase 1. 

Imagen 1: Muestra de la reacción de hipersensibilidad cerebral después de la inyección de las células mesenquimales neuronales a los 24 meses post-operación.

Bibliografía: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27497862/

ADN Recombinante en la Naturaleza, en el manejo artificial y Transgénicos

 ADN Recombinante en la naturaleza 

La conjugación bacteriana es un proceso en donde dos bacterias se transfieren plásmidos o material genético entre sí y suele darse a través del pelo sexual o factor F que es una pilosidad sexual que algunas bacterias poseen. Por ejemplo, bacterias del género Salmonella, poseen el plásmido de conjugación  genético R27 que codifica la proteína RSP, factor de resistencia antibiótica a fármacos como la colistina. 

ADN Recombinante artificial en la Enfermedad Cerebrovascular 

El tratamiento de la enfermedad cerebrovascular requiere de farmacos tromboticos como antitrombitocos. Un estudio de caso demostró que la administración intravenosa del activador de plasminogeno tisular recombinante en una paciente de Asia, mejora la remoción de los coágulos intravasculares en pacientes con ECV luego del tratamiento con idaruzimab, fármaco que revierte el efecto anticoagulante para que exista un estable riesgo sanguíneo y riego de oxígeno a nivel tisular y cerebral.

Disminución de la lesión hipertensa cuatro días después de la administración intravenosa del 
activador de plasminógeno tisular recombinante. 

Animal transgénico 

En la ciuad de Mina Gerais, Brasil, se llevó a cabo la producción de embriones transgénicos bovinos por microinyección de un vector lentiviral pre y posfertilización. Se utilizaron 1700 ovocitos madurados con semen de toro que se los fecundo de manera in vitro.  El vector lentiviral fue producido por transfección transitoria mediante cuatro plásmidos: pMDLg/pRRE, pMD2.G, pRSV-Rev y pLGW; un linaje celular eucarionte HEK-293F y la transfección con los vectores lentivirales se realizó con una mezcla que contenía los cuatros plásmidos, en concentración de 6 ug de ADN de cada uno de los plásmidos estructurales. 

ADN recombinante en la naturaleza: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31527905/
ADN artificial en ECV: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31875786/
Transgénico animal:  https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=7322920

Técnica molecular epigenómica en el estudio del Accidente Cerebrovascular

Tema: El grado de metilación del promotor del gen DHFR como marcador clínico en el diagnóstico de Accidente Cerbrovascular en la población hipertensa de China.
Objetivo:  Evaluar la asociación entre el grado de metilación del gen que codifica para la enzima 
Dihidrofolato reductasa y su influencia en el aparecimiento de Accidente Cerebrovascular.
Muestra:  Plasma sanguíneo 
AN (Ácido nucléico): ADN genómico
G (Gen a amplificar): Promotor del gen DHFR (Dihidrofolato reductasa)

PCR: PCR cuantitativo de metilación específico (Quantitative methylation-specific PCR)
          Desnaturalización: 95ºC x 600 segundos, 
          Hibridación: 56ºC por 45 segundos 
          Elongación: 72ºC por 20 segundos 
V: Electroforesis en gel de agarosa.

Una prueba de tamizaje y una prueba confirmatoria en el Accidente Cerebrovascular

Toma de la presión arterial: prueba de tamizaje en enfermedades cardíacas 

La toma de la presión arterial se la realiza a una población determinada en particular para  detectar una posible enfermedad relacionada con alteraciones cardiovasculares en base a la presión sanguínea ejercida por el corazón hacia los órganos periféricos. Esto permite advertir patologías como  hipertensión arterial o enfermedad cerebrovascular y que estén vinculadas a otras como diabetes o cáncer.

En un estudio realizado a 799 pacientes que presentaban diabetes, signos de daño neurológico e hipertensión arterial; se tomó la presión arterial de los mismos por un periodo de tres a doce meses. Se concluyó que su presión arterial sistólica en el momento de arribar al cuarto de emergencias del hospital era de 166 mm de mercurio y una presión arterial media de 116 mm de mercurio. Estos datos responde a la necesidad fisiológica de mantener una buena perfusión sanguínea a nivel cerebral y mantener niveles de oxígeno estable. 

Análisis de los genes implicados en el ECV mediante PCR: prueba confirmatoria 

Tema: Polimorifismos en el promotor del microRNA 17-92 y su riesgo implicado en el accidente cerebrovascular.
Objetivo:  Investigar la asociación entre tres polimorfismos (rs1491034, rs9301654 y rs982873) en la secuencia promotora del microRNA 17-92 y su riesgo en el aparecimiento de ECV.

microRNA 17-92 
Muestra:  Sangre periferica no coagulada con ácido tetraacético de etilendiamina

AN (Ácido nucléico): ADN genómico
G (Gen a amplificar): Polimorfismos del microRNA 17-92

PCR: PCR  cuantitativo en tiempo real (quantitative real time PCR system)     
          Desnaturalización: 35 ciclos con 20 segundos a 94ºC
          Hibridación: 30 segundos a 59ºC 
          Elongación: 1.5 minutos a 72ºC
V: Secuenciación 

Resultados obtenidos de la toma de la presión arterial. Se utilizó un esfingomanómetro y un estetoscopio. El aparecimiento y desaparecimiento de los sonidos de Korotkoff representó la presión sistólica y la distólica.

Obtenido de: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29777579/  (prueba de confirmación) 

                    https://bmcmedgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12920-019-0589-1 
                    (prueba de tamizaje)